常用的几种PCR方法的策略（一）
降落PCR
另一种提高PCR反应特异性的方法是调整PCR循环的参数。在降落PCR中，前面几个循环的退火温度设定为比引物的最高熔
解温度（Tm）再高几度。
较高的温度有助于避免产生引物二聚体及非特异性引物-模板复合物的形成，因此可减少不希望出现的扩增。因此，在PCR起
始阶段提高退火温度，可减少非特异性PCR产物，增加特异性扩增。
需要注意的是，虽然较高的退火温度能够防止引物二聚体形成和非特异性引物结合，但同时也可能加剧引物与目的序列的解
离，从而降低PCR得率。为克服这一问题，在最初几个循环中，通常会将每个循环的退火温度降低1°C，以获得足量的目标
扩增子。
一旦退火温度达到或“降落”至最佳温度（通常比最低引物Tm低3-5°C），剩下的循环都维持此退火温度。通过这种方法，在
PCR过程中，所期望的PCR产物得到有选择性的增加，同时保证很少或不发生非特异性扩增。
巢式PCR
巢式PCR是标准PCR的一种演变，其增强了反应特异性和目标扩增子的产量。在此方法中，需要设计两对PCR引物：一对
（外引物）在目标扩增区域的侧翼，另一对（巢式引物）对应于待扩增的DNA区域。
其中，外引物用于第一轮PCR，以扩增含有延伸侧翼区域的区域。随后，巢式引物用于第二轮PCR，并以第一轮PCR产物为
模板。
如果第一对引物（外引物）的错配导致非特异性产物被扩增，相同的非特异性区域被第二对引物识别并继续扩增的可能性非
常小，所以通过第二对引物的扩增，PCR的特异性得到了提升。进行两轮PCR的一个优势在于：有助于从有限的起始DNA中
扩增得到足量的产物。
快速PCR
在快速PCR中，通过缩减PCR步骤所需时间来完成更快的扩增，且不会影响扩增产量和效率。快速循环条件尤其适用于具有
高扩增能力的DNA聚合酶，这类聚合酶在每个结合中可引入更多的核苷酸。
高合成能力 Taq 聚合酶所需的延伸时间仅占低合成能力Taq聚合酶所需时间的1/2至1/3，却能维持较高的扩增效率。此
外，如果引物的退火和延伸温度相差无几，则可将它们合并为一步，以进一步缩短PCR时间。这一过程也被称为 两步PCR
法。
当使用低合成能力的 Taq 聚合酶时，如Taq聚合酶，快速循环条件可能适用于 <500 bp左右的短片段。扩增如此大小的片
段通常不需要延长聚合时间，因此可缩短PCR方案中的延伸步骤时间。
为确定最短延伸时间，同时又不损失产物得率，可采用一系列延伸时间递减的方式（几秒）优化PCR。每个目的片段和引物
对都可能会产生变化结果，所以需要在特定条件下对快速PCR进行优化。
快速PCR的另一种调整方式是缩短变性时间，将变性温度提高至98°C。使用这种策略时应注意，非高度热稳定的酶在这种高
温环境下易于变性。
表 .使用低合成能力DNA聚合酶实现快速PCR时所用的反应参数。
使用可实现快速循环的热循环仪和薄壁 PCR管，分别有助于实现快速变温和高效热转移，从而能够大大加速PCR。